病毒可自然感染細(xì)胞，它可將基因送入細(xì)胞核，是高效率的基因傳送系統(tǒng)。目前正在進(jìn)行的2600多項(xiàng)基因治療臨床試驗(yàn)中都離不開(kāi)病毒載體，它發(fā)揮著將外源基因片段遞送到人體細(xì)胞中的重要功能。

目前已有十幾種病毒基因治療產(chǎn)品被批準(zhǔn)用于治療癌癥、傳染病和單基因疾病基因藥物的開(kāi)發(fā)。常用于基因治療的病毒載體包括慢病毒（LV）、腺相關(guān)病毒（AAV）、腺病毒（AdV）和轉(zhuǎn)錄病毒（RV）等，根據(jù)整合及感染情況的不同，適用于不同的療法和適應(yīng)癥。

目前對(duì)于病毒載體產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)管指南和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)仍然比較缺乏，我國(guó)的法規(guī)及指導(dǎo)原則主要有：

?《人基因治療研究和制劑質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》

?2020版《中國(guó)藥典》“人用基因治療制品總論”

?《體內(nèi)（外）基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》

?《溶瘤病毒產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）》

盡管有相關(guān)指導(dǎo)原則的建議，但病毒載體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，種類(lèi)繁多且生產(chǎn)工藝還各不相同，因此對(duì)其的質(zhì)控充滿(mǎn)挑戰(zhàn)，在病毒載體開(kāi)發(fā)過(guò)程中，還需要進(jìn)行全面表征，以期獲得關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

根據(jù)相關(guān)指導(dǎo)原則，病毒載體需要進(jìn)行質(zhì)量研究的項(xiàng)目包括以下幾個(gè)方面：

將外源基因包裝到病毒顆粒中是病毒載體生產(chǎn)的核心技術(shù)，通過(guò)測(cè)序能夠準(zhǔn)確鑒定轉(zhuǎn)入基因組的正確性，常用測(cè)序技術(shù)主要有Sanger、NGS和三代測(cè)序，需要根據(jù)檢測(cè)基因組的長(zhǎng)度和樣本數(shù)量選擇不同的測(cè)序方法。丹納赫生命科學(xué)擁有自動(dòng)化高通量的NGS方案，貝克曼庫(kù)爾特的自動(dòng)化工作站結(jié)合Echo聲波移液處理工作站以及IDT的NGS文庫(kù)構(gòu)建試劑盒，可以快速、準(zhǔn)確地完成NGS的樣本前處理，幫助進(jìn)行序列鑒定。

丹納赫生命科學(xué)NGS解決方案

病毒載體的衣殼蛋白除賦予病毒固有的形狀外，還具有病毒特異的抗原性和輔助感染的作用，影響藥物效能和效價(jià)強(qiáng)度，需要進(jìn)行深入表征。

腺相關(guān)病毒AAV的衣殼主要由VP1、VP2和VP3三種病毒蛋白組成，已有文獻(xiàn)證明HEK 293細(xì)胞和SF9昆蟲(chóng)細(xì)胞兩種表達(dá)系統(tǒng)會(huì)導(dǎo)致AAV衣殼蛋白產(chǎn)生不同的翻譯后修飾，這些翻譯后修飾的差異可能對(duì)rAAV受體結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)、表達(dá)動(dòng)力學(xué)、表達(dá)耐久性、載體免疫原性等產(chǎn)生影響。因此，強(qiáng)烈建議對(duì)組成AAV的蛋白質(zhì)進(jìn)行完整表征，包括序列和翻譯后修飾，以確保AAV產(chǎn)品的質(zhì)量和一致性。

丹納赫生命科學(xué)旗下SCIEX擁有完整的AAV衣殼蛋白表征方案。高分辨質(zhì)譜對(duì)兩種不同表達(dá)體系的AAV衣殼蛋白分子量檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)其蛋白形式的差異性。自測(cè)的樣品中發(fā)現(xiàn)SF9中VP1和VP2的磷酸化水平升高，HEK293中VP3的乙酰化更加完全。

SCIEX X500B對(duì)兩種表達(dá)系統(tǒng)中

AAV衣殼蛋白的分子量進(jìn)行檢測(cè)

再將樣品酶解后通過(guò)對(duì)肽圖的分析，可以進(jìn)一步確認(rèn)翻譯后修飾以及所發(fā)生的位點(diǎn)。SCIEX 高分辨質(zhì)譜ZenoTOF^TM 7600系統(tǒng)獨(dú)有的EAD碎裂模式，可以對(duì)在CID碎裂中容易發(fā)生中性丟失的修飾進(jìn)行位點(diǎn)確認(rèn)，提高肽圖序列覆蓋度。

肽圖分析實(shí)驗(yàn)流程

翻譯后修飾分析結(jié)果

另外，采用毛細(xì)管電泳CE-SDS的方法可以方便、快速地對(duì)AAV三種結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行純度分析。SCIEX的毛細(xì)管電泳PA 800 Plus制藥分析系統(tǒng)配置激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器，可以對(duì)低濃度的不同血清型AAV衣殼蛋白進(jìn)行三種結(jié)構(gòu)蛋白的分離檢測(cè)。

CE-SDS-LIF分析不同血清型的AAV衣殼蛋白

（Dr. ZICHUAN ZHANG,  et al）

SCIEX PA 800 Plus制藥分析系統(tǒng)

慢病毒的核心蛋白主要有核衣殼蛋白(p7) 、內(nèi)膜蛋白 (p17) ，衣殼蛋白(p24) 、兩種薄膜糖蛋白以及其他非結(jié)構(gòu)蛋白組成，其中p24 是構(gòu)成慢病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是常用于進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)的指標(biāo)。SCIEX的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)還可以對(duì)慢病毒的核心蛋白進(jìn)行譜圖分析，用以進(jìn)行慢病毒蛋白的純度評(píng)估。通過(guò)在慢病毒樣本中添加p24標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行p24蛋白的鑒定以及滴度檢測(cè)。

SCIEX Biophase 8800對(duì)慢病毒的蛋白譜檢測(cè)

在病毒載體的工藝生產(chǎn)中，為了確保病毒載體在臨床轉(zhuǎn)化研究和試驗(yàn)上的功效和安全性，對(duì)空衣殼病毒顆粒和完整病毒顆粒的比率進(jìn)行快速和準(zhǔn)確的分析是十分重要的。貝克曼庫(kù)爾特的分析型超速離心機(jī)Optima AUC已廣泛應(yīng)用于病毒載體顆粒的空殼率檢測(cè)和生產(chǎn)過(guò)程中的定量。它能精確表征樣本中各個(gè)組分的異質(zhì)性、聚集體、空殼顆粒、包裝部分基因組的顆粒和包裝完整基因組的實(shí)心顆粒，測(cè)定它們之間的相對(duì)含量，大大提高了分辨率。

Methods & Clinical Development(2018).

Analytical Biochemistry (2008).

基因組分析是制造過(guò)程中病毒載體樣本的另一個(gè)重要質(zhì)量屬性，毛細(xì)管電泳儀亦是進(jìn)行核酸分析的重要工具，SCIEX的毛細(xì)管電泳系統(tǒng)可進(jìn)行病毒載體基因組完整性和宿主殘留DNA的片段分布檢測(cè)。

AAV（左），LV（右）

對(duì)于微生物、熱源、不溶性微粒等工藝過(guò)程相關(guān)雜質(zhì)，丹納赫生命科學(xué)則擁有多功能酶標(biāo)儀、不溶性微粒檢測(cè)儀、潔凈室空氣顆粒計(jì)數(shù)儀等來(lái)滿(mǎn)足日常質(zhì)控檢測(cè)的需要。

貝克曼庫(kù)爾特的Metone 3400+潔凈室空氣顆粒計(jì)數(shù)儀（右）