背景介紹

多年來，在平面培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的單層細(xì)胞模型（2D 模型）一直是研究疾病機(jī)制和評(píng)估潛在新藥療效的便捷系統(tǒng)，2D 生長(zhǎng)的癌細(xì)胞系長(zhǎng)久以來則是癌癥模型的實(shí)驗(yàn)替代品。但近年來，癌細(xì)胞以及其他細(xì)胞類型，以三維（3D）格式培養(yǎng)能夠形成多層結(jié)構(gòu)，成為疾病研究的新模型。而這些模型在生物學(xué)上更具相關(guān)性。

雖然通常需要成像和高內(nèi)涵分析來獲得候選藥物對(duì)復(fù)雜 3D 細(xì)胞模型影響的詳細(xì)信息，但同時(shí)也需要直接的基于細(xì)胞的分析以評(píng)估單個(gè)參數(shù)，如整體細(xì)胞活力。三磷酸腺苷 ATP 檢測(cè)是一種廣泛使用的評(píng)估治療手段對(duì)細(xì)胞活性影響的方法，在這個(gè)方法中，代謝活躍的細(xì)胞利用 ATP 作為能量來源；當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)受損或耗盡時(shí)，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì) ATP 的快速下降，用于測(cè)量 ATP 的分析方法通常是讀取基于熒光素酶反應(yīng)的發(fā)光讀數(shù)。這個(gè)方法需要活細(xì)胞提供 ATP（圖 1 ），并且由于細(xì)胞和試劑中缺乏背景發(fā)光，反應(yīng)非常靈敏。ATP 檢測(cè)的快速讀數(shù)可用于快速篩選一大組化合物，并識(shí)別顯著影響細(xì)胞活性的子集。然后，這個(gè)簡(jiǎn)化的集合可以應(yīng)用于更集中的后續(xù)研究，包括提供更多表型細(xì)節(jié)的通量實(shí)驗(yàn)。

圖一：熒光素酶反應(yīng)用于測(cè)量細(xì)胞活力。細(xì)胞被溶解并加入熒光素酶反應(yīng)，在那里它們提供產(chǎn)生發(fā)光所需的 ATP ，活細(xì)胞越多，產(chǎn)生的光信號(hào)就越多。

在這里，我們介紹一項(xiàng)小規(guī)模研究，是使用CellTiter Glo 3D 細(xì)胞活性分析試劑盒（Promega）測(cè)量的 2D 和 3D 細(xì)胞樣本的細(xì)胞活性。我們分析了以下兩種細(xì)胞類型的 2D 和 3D 細(xì)胞樣本的活性，并用幾種先前測(cè)試過的化合物進(jìn)行了測(cè)試：MCF-7，一種常用的雌激素受體（ER）和孕酮受體（PR）陽性的乳腺癌細(xì)胞系；以及 TU-BcX-4IC，患者來源的腫瘤外植體，來作為三陰性（ER、PR 和 HER2 陰性）亞型化生性乳腺癌的代表模型。使用 SpectraMax iD5 微孔板讀板器進(jìn)行檢測(cè)，該讀板器具有超冷型 PMT ，可實(shí)現(xiàn)低背景發(fā)光和高靈敏度。所有數(shù)據(jù)均使用 SoftMax Pro 軟件進(jìn)行分析，包括曲線擬合和 IC₅₀ 計(jì)算。

實(shí)驗(yàn)材料

• CellTiter-Glo 3D 細(xì)胞活性分析試劑盒 （Promega cat. #G9682）

• MCF7 乳腺癌細(xì)胞系（ATCC cat. #HTB-22）

• TU-BcX-4IC 患者來源的原發(fā)性三陰性乳腺癌細(xì)胞（由杜蘭大學(xué) M.Burow 實(shí)驗(yàn)室慷慨提供）

• MCF7 細(xì)胞系培養(yǎng)基：MEM（Corning cat. #10-010-CV） + 10% 胎牛血清（FBS, Avantor Seradigm cat. #1500-500）+ 1% Antibiotic-Antimycotic （Gibco 15240-062） + 0.01% mg/mL 人重組胰島素（Gibco cat. #12585-014）

• TU-BcX-4IC 細(xì)胞系培養(yǎng)基：DMEM （Corning cat. #15-017-CV） + 10% 胎牛血清（FBS, Avantor Seradigm cat. #1500-500） + 1% Antibiotic-Antimycotic（Gibco cat. #15240-062）+ 1% NEAA（Gibco cat. #11140-050）+ 0.01% mg/mL 人重組胰島素（Gibco cat. #12585-014）

• 384 孔 PrimeSurface 3D 白色培養(yǎng)板，超低附著，U 底微孔板（Sbio cat. #MS-9384WZ）

• 384 孔白板，組織培養(yǎng)處理，固體底部微孔板（Thermo Fisher Scientific cat. #164610）

• 測(cè)試化合物：硼替佐米（Tocris cat. #7282） /伊布替尼（Tocris cat. #6813） / 鹽酸阿柔比星（Selleck Chemicals cat. #S1228） /帕諾比諾斯（Selleck Chemicals cat. #S1030）/ 羅咪酯肽（R&D Systems cat. #3515） /曲美替尼（Selleck Chemicals cat. #S2673）

• SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī)（Molecular Devices）

實(shí)驗(yàn)方法

• 細(xì)胞制備

3D 球體：MCF7 或 TU-BcX-4IC 細(xì)胞以每孔 2500 個(gè)細(xì)胞的量加入 384 孔 U 底微孔板，以 1000 rpm 離心平板 1 分鐘聚集細(xì)胞，然后將培養(yǎng)板在 37°C、5%CO₂ 下培養(yǎng) 72 小時(shí)。

2D 單層培養(yǎng)：以每孔 5000 個(gè)細(xì)胞將 MCF7 接種到 384 孔平底微孔板中，然后在 37°C、5%CO₂ 下培養(yǎng)板 24 小時(shí)，TU-BcX-4IC 細(xì)胞以每孔 2500 個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，然后培養(yǎng) 48 小時(shí)。

• 化合物處理

以 2D 和 3D 培養(yǎng)的 TU-BcX-4IC 和 MCF7 細(xì)胞在四個(gè)重復(fù)的微孔中處理，以 1:5 梯度稀釋 romidepsin 為 50 nM 至 0.006 nM。細(xì)胞與化合物在 37°C 、 5%CO₂ 下培養(yǎng) 72 小時(shí)。兩種培養(yǎng)形式的 TU-Bcx-4IC 細(xì)胞也用硼替佐米、ibrutinib、鹽酸依達(dá)比星、帕諾比諾和曲美替尼處理。細(xì)胞與化合物在 37°C、5%CO₂ 下培養(yǎng) 72 小時(shí)。

孵育后，將 CellTiter Glo 3D 試劑添加到樣本孔中。對(duì)于 3D 球體，搖動(dòng)平板 5 分鐘，然后在室溫下培養(yǎng) 30 分鐘，以便在讀數(shù)前進(jìn)行細(xì)胞裂解。對(duì)于 2D 培養(yǎng)，將平板搖晃 2 分鐘，然后在室溫下培養(yǎng) 10 分鐘，然后讀取熒光值。使用表 1 所示的發(fā)光檢測(cè)模式和設(shè)置，在 SpectraMax iD5 讀板器上讀取數(shù)值。所有數(shù)據(jù)分析和繪圖均使用 SoftMax Pro 軟件完成。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

每組處理細(xì)胞的樣本結(jié)果均使用 SoftMax Pro Software 中的 4 參數(shù)擬合，其中每條曲線的 C 參數(shù)被視為 IC₅₀ 值。在用 Romidepsin 處理的 MCF7 細(xì)胞中，3D 培養(yǎng)細(xì)胞的 IC₅₀ 濃度略高于單層培養(yǎng)細(xì)胞（圖2）。與 2D 細(xì)胞相比，經(jīng) Romidepsin 處理的 TU-BcX-4IC 在 3D 培養(yǎng)細(xì)胞中的 IC₅₀ 稍低（圖 2E）。對(duì)于其他測(cè)試的化合物，3D 培養(yǎng)細(xì)胞的 IC₅₀ 值通常更高，3D 和 2D 培養(yǎng)結(jié)果之間的差異通常約為兩到三倍（圖 3 ，表 2 ）。

經(jīng) Romidepsin 處理的 TU-BxC-4IC 和 MCF7 細(xì)胞之間存在明顯差異。在 2D 培養(yǎng)中，兩種細(xì)胞類型的 IC₅₀ 值相似，分別為 1.13 nM 和 1.88 nM。然而，在 3D 培養(yǎng)中，TU-BxC-4IC 細(xì)胞的 IC₅₀ 值為 0.443 nM，比 MCF7 細(xì)胞的 5.28 nM 低 12 倍，這表明 TU-BcX-4IC 細(xì)胞培養(yǎng)方法對(duì)這些細(xì)胞的反應(yīng)的影響比 MCF7 細(xì)胞的影響更大。

表一：CellTiter Glo 3D 分析的 SpectraMax iD5 讀板器軟件設(shè)置。具體設(shè)置在 SoftMax Pro 軟件的板部分中指定。通過選中“更多設(shè)置”下的“顯示預(yù)讀取優(yōu)化選項(xiàng)”旁邊的框，并遵循啟動(dòng)讀取后出現(xiàn)的說明，可以優(yōu)化讀取高度。

圖二：3D 和 2D 培養(yǎng) MCF7 細(xì)胞的化合物反應(yīng)。以 3D（紅色）和 2D（藍(lán)色）培養(yǎng)的 MCF7 細(xì)胞，用羅美肽處理。3D 和 2D 的IC₅₀ 值分別為 5.28 nM 和 1.88 nM。

圖三：三維和二維培養(yǎng) TU-BcX-4IC 細(xì)胞的化合物反應(yīng)。紅色表示三維培養(yǎng)的細(xì)胞，而藍(lán)色表示二維培養(yǎng)的細(xì)胞。A、 romidepsin 處理的細(xì)胞；B、 硼替佐米；C、 伊布替尼；D、 依達(dá)比星；E、 變阻器；F、 特拉梅蒂尼布。

表二：藥物處理細(xì)胞的 IC₅₀ 值。列出了培養(yǎng)為球形（3D）或單層（2D）的 MCF7 和 TU-BcX-4IC 細(xì)胞的值。所示 IC₅₀ 濃度單位為 nM 。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

使用熒光素酶在不同實(shí)驗(yàn)條件下讀取細(xì)胞內(nèi)相對(duì) ATP 濃度發(fā)光讀數(shù)的分析為快速評(píng)估細(xì)胞活力提供了一種便捷方法。細(xì)胞可以放置在 U 形底板中，在那里它們很容易形成球體；并且可以進(jìn)行藥物處理和 ATP 檢測(cè)，而無需清洗微孔或轉(zhuǎn)移球體。由此得到的細(xì)胞活性數(shù)據(jù)本身需要通過其他方法（如高內(nèi)涵成像）進(jìn)行進(jìn)一步研究的化合物或治療方法。

在本應(yīng)用文章中，我們證明了使用 CellTiter Glo 3D 分析比較不同化合物處理兩種不同細(xì)胞類型（生長(zhǎng)為球形或單層）的活性的結(jié)果的可行性。所述的細(xì)胞培養(yǎng)方法和檢測(cè)方法易于建立，適合中高通量篩選。SpectraMax iD5 通過 SoftMax Pro Software 自動(dòng)化的數(shù)據(jù)分析和曲線擬合，提供穩(wěn)健分析讀數(shù)所需的靈敏度。