以下文章來源于BioscienceProtocols ，作者Bio-protocol

摘要

本實驗以SYTOX Green作為熒光探針對熱激處理后死亡的秀麗線蟲進行染色標記，利用高內涵成像系統(tǒng)自動化拍攝并分析相應的熒光圖像，再以熱圖、散點圖等形式對實驗結果進行可視化呈現(xiàn)，便于快速、高效、直觀地篩選候選樣品以用于后續(xù)驗證與分析。

關鍵詞: 熱激, 高內涵成像, 秀麗線蟲, 高通量篩選

背景

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，以下簡稱“秀麗線蟲”）作為常見的模式生物之一，具有生命周期短、繁殖速度快、實驗操作簡單、遺傳資源豐富、關鍵信號通路與人類同源性高等突出優(yōu)點，因而是探尋疾病發(fā)生機制和構建新藥篩選模型的強有力動物模型。其中，秀麗線蟲群體存活率是其整體健康狀況和抗脅迫能力的綜合表現(xiàn)，因此，針對野生型和疾病模型建立快速、準確的存活狀態(tài)鑒定方法有望在活性先導化合物發(fā)現(xiàn)領域得到廣泛應用，其特色之一是在整體動物水平進行高效篩選。

熒光染料標記是高效鑒定秀麗線蟲存活狀態(tài)的重要方法。其中，SYTOX Green染料比較容易穿過死細胞的細胞膜，然后與DNA結合并發(fā)出較強的綠色熒光信號 (激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長520 nm)，但不能對活細胞進行染色 。據(jù)此，利用高內涵成像系統(tǒng)分析比較單個或多個平行孔內的秀麗線蟲綠色熒光面積大小可以直接檢測其死亡率高低，從而快速、高效地評價受試樣品增強秀麗線蟲在脅迫條件下存活能力的作用。

一、秀麗線蟲同步化處理                

1.取1.5 ml EP管收集產(chǎn)卵期的N2成蟲，用0.5 ml的M9緩沖液重懸后，加入等體積新鮮配置的線蟲裂解液在室溫下裂解3~5分鐘以釋放蟲卵。

2.在室溫和2,000 × g條件下離心1 min收集蟲卵，加入1 ml的M9緩沖液重懸蟲卵后再次離心收集。重復洗滌步驟3次。

3.吸取~20 ml的S Medium溶液重懸蟲卵，轉移至50 ml的無菌錐形瓶，放置于20 °C振蕩培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜以獲得同步化的L1期幼蟲。

4.在37 °C過夜培養(yǎng)NA22至菌液OD_570nm約為0.5，然后離心濃縮10倍。調節(jié)秀麗線蟲密度至20~30條/10 μl，加入1/10體積的濃縮菌液作為食物，將錐形瓶放回20 °C振蕩培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)42 h至秀麗線蟲生長到L4期。

1.從大腸桿菌NA22平板上挑取一個單菌落接種到含有50 ml LB液體培養(yǎng)基的無菌錐形瓶中，放入37 °C振蕩培養(yǎng)過夜。

2.將菌液均分轉移至兩個50 ml離心管中，在4 °C和8,000 × g條件下離心5 min，倒出培養(yǎng)液，加入5 ml的S Medium重懸，配制成10× NA22濃縮菌液備用。

3.分別吸取10 μl濃縮菌液加入到384孔板內3個含有70 μl S Medium的平行孔中，充分混勻后利用酶標儀在570 nm處讀取溶液的OD值。通過加入（或經(jīng)離心后吸出）適量的S medium，調節(jié)NA22菌液濃縮程度至孔內菌液OD570nm約為0.4。

三、熱激實驗的培養(yǎng)液分配             

1.按照表1配制熱激實驗所需的培養(yǎng)液。各孔溶液終體積為80 μl。

2.取步驟1中同步化的L4期N2秀麗線蟲，經(jīng)M9緩沖液清洗3次去除殘留的食物，再用COPAS Biosort將其按照每孔25條定量分配至384孔板各孔中，以每分配一條秀麗線蟲帶入1 μl培養(yǎng)液的量粗略計算蟲液總體積即為25 μl。

3.秀麗線蟲分配完成后，384孔板加蓋并用長條形Parafilm封口膜將微孔板邊緣 (蓋子與板底接觸部位) 纏繞一圈，置于倒置顯微鏡下觀察孔內秀麗線蟲的條數(shù)及狀態(tài)，若無特殊問題即可放入20 °C培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)2天。

表1.384孔板每孔所需的試劑體積及其終濃度

四、染色與熱激處理                             

1.從-20 °C取出SYTOX Green染料母液，常溫下避光融化。

2.用移液工作站分別吸取10 μl SYTOX Green染料母液至各孔，輕輕振蕩以混勻。此時染料終濃度為1 μM。

3.用錫箔紙將384孔板包裹以避光，放入35 °C振蕩培養(yǎng)箱中熱激處理16 h。

五、圖像獲取與分析                          

1.將微孔板從培養(yǎng)箱中取出，揭掉Parafilm封口膜 (不用揭開蓋子)，放入高內涵成像設備ImageXpress® Micro的讀板槽中，在2x物鏡下選用綠色熒光 (FITC) 和明場 (TL20%) 兩個拍攝通道，曝光時間分別設置為50 s和60 s，選用“Laser and Image-Based Autofocusing”自動對焦模式，點擊“Acquire Plate”自動拍攝各孔的明場圖像和熒光圖像。

2.拍照完成后點擊“Review Plate Data”，找到對應孔板編號的原始數(shù)據(jù)，利用自定義分析模塊自動化分析各孔秀麗線蟲FITC圖像的平均總熒光面積 (Total Area_Sum) 及識別到的物體個數(shù) (Cell Count)，計算兩者的乘積即為各孔秀麗線蟲總熒光面積。

結果分析

本實驗選取L4期秀麗線蟲N2經(jīng)給藥培養(yǎng)48 h后，加入SYTOX Green熒光染料，并在35℃C高溫下熱激處理16 h，使用高內涵成像系統(tǒng)對384孔板（每孔代表一個受試樣品）進行圖像拍攝及數(shù)據(jù)分析。代表性實驗結果如圖1所示，其中圖1A以熱圖形式展示了各孔內的平均總熒光面積（Total Area_Sum），再乘以各孔識別到的物體個數(shù)（Cell Count），可得到各孔秀麗線蟲總熒光面積（Fluorescence Area）。該數(shù)值越大，代表死亡率越高（即為陰性結果）; 相反，該數(shù)值越小，代表存活率越高（即為陽性結果）。圖1B以散點圖的形式展示了各孔對應的秀麗線蟲總熒光面積大小，可根據(jù)受試，樣品規(guī)模及受試實驗需要來設定候選樣品的判定標準，如選擇偏離總體平均值（黑色橫實線）50%的上限值（紅色橫虛線）和下限值（綠色橫虛線）為進入下一輪活性篩選的判定標準。此處我們挑選總熒光面積小于上述下限值的樣品作為候選活性樣品用于后續(xù)實驗驗證。若應用于高通量篩選的大數(shù)據(jù)分析，還可以參考使用其它的數(shù)據(jù)均一化處理方法，如Z評分、B評分等。

圖1：基于高內涵成像系統(tǒng)檢測的秀麗線蟲熱激存活率

• 微孔板放入35 °C振蕩培養(yǎng)箱進行熱激處理時，應盡量避免振蕩器內部風機直接吹向384孔板，可用硬紙片擋在在兩者之間，減少吹風散熱作用導致的板內各孔間的溫度差異及邊緣效應。

• 由于384孔板的孔面積較小，孔內液體會在表面張力作用下產(chǎn)生四周液面高、中間液面低的現(xiàn)象，從側面看孔內液面呈U型。這種現(xiàn)象會影響明場通道 (TL20%) 透射光的路徑，導致高內涵成像系統(tǒng)拍攝出來各孔明場圖像的周邊顏色較暗而中央部位較明亮，但并不影響FITC通道熒光圖像的檢測結果。實驗結果表明適當增加孔內溶液體積可減弱這種干擾現(xiàn)象，推薦80~100 μl作為每孔溶液的終體積大小。

• SYTOX Green染料在使用過程中要注意避光，從而減少受試樣品溶液背景熒光 (噪聲) 干擾。