由于不插入宿主基因組、免疫原性低，同時(shí)宿主范圍廣、表達(dá)時(shí)程長(zhǎng)、在體感染特異性好等特點(diǎn)，使腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV）正成為廣泛使用的基因治療病毒載體之一。目前，已經(jīng)有三款基于AAV載體的基因治療藥物上市，且有百多項(xiàng)AAV載體基因治療臨床試驗(yàn)在全球開(kāi)展 。因此開(kāi)發(fā)穩(wěn)定的AAV病毒生產(chǎn)工藝對(duì)研發(fā)、臨床研究及商品化都非常重要。

AAV的生產(chǎn)通常使用三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法，三質(zhì)粒系統(tǒng)在293T細(xì)胞中進(jìn)行包裝，然后采用機(jī)械或化學(xué)裂解的方法從細(xì)胞中收獲AAV載體，細(xì)胞裂解后，可使用Benzonase處理，降低粘度，去除游離的核酸，對(duì)于科研級(jí)應(yīng)用，傳統(tǒng)采用密度梯度超速離心進(jìn)行純化，對(duì)于大規(guī)模培養(yǎng)，使用一次性生物反應(yīng)器進(jìn)行GMP級(jí)生產(chǎn)，收獲階段使用深層過(guò)濾或切向流過(guò)濾去除不溶性細(xì)胞成分，然后再用多步層析提高AAV載體純度，在除菌過(guò)濾之前選擇切向流過(guò)濾濃縮病毒載體，從而達(dá)到制劑濃度。在生產(chǎn)工藝中，丹納赫旗下Pall及Cytiva具有質(zhì)粒發(fā)酵及AAV載體制備的完整解決方案。

AAV載體的工藝流程解決方案

在AAV載體的生產(chǎn)工藝上，對(duì)載體生產(chǎn)的純度有很高要求。AAV空病毒衣殼不含有治療基因但會(huì)引起免疫反應(yīng)，而且空衣殼會(huì)和完整衣殼競(jìng)爭(zhēng)感染患者細(xì)胞，若要達(dá)到治療效果就需要加大劑量，會(huì)帶來(lái)高劑量副作用。所以用合適的方法檢測(cè)AAV載體生產(chǎn)中的空殼率是也目前亟待解決的問(wèn)題。采用貝克曼庫(kù)爾特的分析型超速離心機(jī)AUC進(jìn)行空殼率檢測(cè)是有效的手段之一。由于AAV空衣殼與完整衣殼的分子量相差非常小，所以需要采用高分辨的方法進(jìn)行檢測(cè)。AUC采用沉降速率法，可區(qū)分及量化空載體、全基因組載體、部分組裝載體、聚集狀態(tài)的載體及其他雜質(zhì)碎片等，且AUC方法不需要更換溶液體系及對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)記，不會(huì)對(duì)樣品造成破壞，并適用于不同血清型AAV載體。

AUC對(duì)rAAV顆粒狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)（Wang et al. (2019). Mol Ther Methods Clin Dev, 15, 257-263.）

此外，SCIEX的PA800 Plus毛細(xì)管電泳制藥分析系統(tǒng)亦可對(duì)AAV的不同組裝狀態(tài)進(jìn)行分析。由于AAV衣殼表面的氨基酸側(cè)鏈會(huì)造成AAV具有特定的等電點(diǎn)（Isoelectric Point，pI），其內(nèi)部核酸的填充情況也會(huì)造成AAV等電點(diǎn)的差異，同時(shí)不同的血清型也可影響產(chǎn)品的等電點(diǎn)，所以通過(guò)用等電聚焦電泳模式對(duì)AAV載體進(jìn)行pI值檢測(cè)可用于AAV的種類鑒別及組裝情況的分析。

用毛細(xì)管電泳還可進(jìn)行AAV的衣殼蛋白純度分析及宿主細(xì)胞殘留DNA（HCD）的片段分布檢測(cè)。AAV衣殼由三種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1、VP2和VP3）組成，其比例和純度都會(huì)影響藥物的效能和效價(jià)，需要被鑒定并監(jiān)控以確保藥物質(zhì)量，且AAV產(chǎn)品具有多種血清型，普遍濃度較低，需要一種針對(duì)不同血清型均具有較高分離度和靈敏度的分析方法。PA800 Plus采用激光誘導(dǎo)熒光的檢測(cè)方式對(duì)AAV衣殼蛋白的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行純度檢測(cè)，可將VP1、VP2、VP3進(jìn)行基線分離，檢出限可達(dá)1×10⁹ GC/mL。

CE-SDS-LIF方法分析AAV 10的衣殼蛋白純度

FDA關(guān)于人類基因治療新產(chǎn)品生產(chǎn)指導(dǎo)文件中明確指出HCD的片段要小于200 bp；NMPA生物制品藥學(xué)部同樣在基因治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則的征求意見(jiàn)稿中指出，HCD的片段要小于200 bp。PA800 Plus用激光誘導(dǎo)熒光的檢測(cè)方式可檢測(cè)10pg/mL的DNA片段濃度, 若在前處理的過(guò)程中對(duì)DNA進(jìn)行濃縮處理，還可獲得更高的檢測(cè)靈敏度，同時(shí)可檢測(cè)50bp-1000bp的片段大小，且可進(jìn)行條件優(yōu)化檢測(cè)長(zhǎng)至15kb的片段大小，滿足各種殘留DNA檢測(cè)的要求。

PA800 Plus進(jìn)行DNA片段標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)圖譜

另外，病毒衣殼蛋白需要由正確的蛋白序列制成，并且它們通常需要加上特定的翻譯后基團(tuán)才能在細(xì)胞中充分發(fā)揮活性。這方面質(zhì)量研究，可通過(guò)肽圖分析方法進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS / MS）可完成相關(guān)肽圖分析，它可繪制出AAV顆粒在細(xì)胞中發(fā)揮正常功能所需的主要蛋白質(zhì)序列和翻譯后修飾信息。

高分辨質(zhì)譜對(duì)AAV衣殼蛋白的序列覆蓋度及翻譯后修飾進(jìn)行檢測(cè)

腺相關(guān)病毒正成為基因治療領(lǐng)域中非常重要的具有廣泛應(yīng)用前景的明星載體工具，丹納赫生命科學(xué)具有從工藝到表征的完整解決方案，幫助用戶應(yīng)對(duì)AAV大規(guī)模生產(chǎn)中的挑戰(zhàn)。