2020注定是不同尋常的一年，新年伊始本該是舉國同慶、合家歡樂的時(shí)刻，我國卻爆發(fā)了新型冠狀病毒肺炎疫情。其實(shí)不僅是我國，澳洲的山火持續(xù)燃燒了四個(gè)多月，數(shù)億動物死亡，30萬只蝙蝠入侵；美國爆發(fā)40年來最致命流感，超10000人死亡，1900萬人感染；東非爆發(fā)遮天蔽日的蝗災(zāi)；巴西罕見暴雨，2萬人流離失所；菲律賓火山噴發(fā)，數(shù)萬居民撤離；克什米爾雪崩，至少76人死亡；一代籃球巨星科比?布萊恩特墜機(jī)遇難，圈友們紛紛表示希望重啟2020。

現(xiàn)在，我們給大家分析下現(xiàn)在新冠病毒是如何進(jìn)行檢測的，后續(xù)疫苗和新藥研發(fā)進(jìn)展如何？

1.新型冠狀病毒肺炎現(xiàn)狀 2019-nCoV

截至 3 月 1 日，全球累計(jì)報(bào)告新冠肺炎確診病例 86990，其中我國報(bào)告確診病例 79968，死亡人數(shù)超 2000。《中華流行病學(xué)雜志》17 日發(fā)表了一篇名為《新型冠狀病毒肺炎流行病學(xué)特征分析》的論文。該論文指出，新冠肺炎病毒比 SARS（非典型肺炎）和 MERS（中東呼吸綜合征冠狀病毒）更具傳染性。新冠肺炎病毒有向全球蔓延的趨勢，近日意大利、日本、韓國的確診病例數(shù)持續(xù)增加。

1.1 背景介紹

2019 年12月，武漢市出現(xiàn)了一系列不明原因肺炎，傳染性極強(qiáng)。2020年1月9日，科學(xué)家在電子顯微鏡下，觀察到引起此次不明原因肺炎的病原體呈現(xiàn)有包膜的、具有類似日冕外形的典型冠狀病毒形態(tài)。結(jié)合基因組測序結(jié)果，證實(shí)為人類新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）。2月11日世界衛(wèi)生組織將其命名為“COVID-19”(coronavirus disease 2019) 。那么到底什么是冠狀病毒，為何它如此狡猾？

1.2 像“皇冠”一樣的冠狀病毒

冠狀病毒屬于冠狀病毒科類病毒目(Nidovirales)的一種包膜型無節(jié)段陽性RNA病毒，廣泛分布于人類和其他哺乳動物。因其形態(tài)在電鏡下觀察類似日冕的棘突或者是王冠而得名。

圖 1. 冠狀病毒。圖片來源：https://www-sciencedirect-com-hk.vtrus.net/

在自然界中，冠狀病毒廣泛存在于動物體內(nèi)，但是，它有一個(gè)明顯的特點(diǎn)是“必須依賴宿主細(xì)胞才能繁衍”。一些冠狀病毒感染后可造成人畜共患病。已知的人類冠狀病毒共有七型，其中三種對我們?nèi)祟惖摹皻Α本薮蟆＿@就是2019年武漢暴發(fā)的COVID-19（新型冠狀病毒肺炎）、2003年首現(xiàn)于中國大陸隨后擴(kuò)散到世界29個(gè)國家和地區(qū)的SARS（嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合征）病毒、2012年出現(xiàn)在沙特并擴(kuò)散到27個(gè)國家的MERS（中東呼吸綜合征病毒）。

1.3 病毒來源

經(jīng)全基因組序列比較，2019-nCoV Wuhan-Hu-1病毒株（GenBank MN908947）與中國科學(xué)家從蝙蝠體內(nèi)分離到的SARS-like CoV ZC45病毒株（2017年2月，GenBank MG772933）全基因組的一致性約89%，僅比較棘突蛋白（Spike, S）基因序列，2019-nCoV Wuhan-Hu-1病毒株（GenBank MN908947）與蝙蝠SARS-like CoV ZC45病毒株一致性約84%。據(jù)此推測，新冠病毒由蝙蝠感染到人類可能接觸的動物，即經(jīng)中間宿主適應(yīng)演化，再感染人類。截至目前，全球科學(xué)家們還未明確此次病毒的中間宿主。

2.病毒類疾病的檢測

新型冠狀病毒由于具有比 SARS 和 MERS 更強(qiáng)的傳染性，因此首先要切斷傳染源，防止疫情進(jìn)一步擴(kuò)散，同時(shí)通過各種手段盡快檢測出確診患者并隔離治療。

病毒檢測常用方法有以下幾種：

2.1 基于核酸水平的檢測（RT-PCR/測序）

新冠肺炎疫情爆發(fā)之后，我國科學(xué)家就快速確定了新冠病毒的全基因組序列，并于 1 月 11 日與世界衛(wèi)生組織分享這一信息。我國已有 7 款新冠病毒核酸檢測試劑盒獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)。

2 月 19 日國家衛(wèi)健委辦公廳下發(fā)的《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第六版）》中指出，新冠肺炎疑似病例需具備以下病原學(xué)證據(jù)之一才可確診，一是實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 檢測新型冠狀病毒核酸陽性，二是病毒基因測序后與已知的新型冠狀病毒高度同源。由于二代測序檢測成本問題，目前多數(shù)采用 RT-PCR 方法檢測。

但在一些新聞報(bào)道中提及，RT-PCR 方法有時(shí)會出現(xiàn)假陰性（患者臨床檢測已出現(xiàn)“大白肺”，核酸檢測卻是陰性），導(dǎo)致疑似患者無法確診治療。作者推測，一方面可能是當(dāng)前檢測試劑盒本身的靈敏度無法檢測到發(fā)病初期患者較低的病毒拷貝數(shù)，或者是檢測試劑盒批次間穩(wěn)定性不夠；另一方面，由于疑似病例眾多，各地 CDC 專業(yè)人員無法滿足檢測需求將檢測權(quán)限下放，而一線檢測人員由于沒有經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)，在采樣、核酸提取和 qPCR 檢測過程中，可能由于試劑盒操作步驟繁瑣或操作不當(dāng)導(dǎo)致一些誤診。

現(xiàn)在試劑盒生產(chǎn)公司也在優(yōu)化產(chǎn)品質(zhì)量，簡化操作步驟；國家也規(guī)范了采樣標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)報(bào)道已有最快 15 分鐘即可出結(jié)果的試劑盒問世，這大大縮短了新冠病毒肺炎從疑似到確診的時(shí)間。

2.2基于蛋白水平的檢測（抗原/抗體檢測）

新型冠狀病毒的 RNA 核心外，由蛋白質(zhì)外殼包裹，表面突出的是刺突蛋白（S Protein），它是侵染宿主細(xì)胞的關(guān)鍵。2 月 19 日，美國得克薩斯大學(xué)奧斯汀分校(University Of Texas At Austin)和美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes Of Health)的研究人員于《科學(xué)》（Science）雜志在線發(fā)文，他們利用冷凍電鏡技術(shù)解析了刺突蛋白（Spike Protein）的分子結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)它跟 SARS 病毒一樣，與人體細(xì)胞表面的 ACE2（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶 2）受體作用，從而入侵細(xì)胞。它與ACE2的親和力是 SARS 病毒的 10-20 倍，這很可能是導(dǎo)致高度傳染性的原因。

圖 2. 新冠病毒刺突蛋白結(jié)構(gòu)。圖片來源：Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation

新冠病毒刺突蛋白是與人體細(xì)胞結(jié)合的關(guān)鍵靶點(diǎn)，對其分子結(jié)構(gòu)的解析，可以幫助研究人員順利開展以下研究工作。第一，設(shè)計(jì)可以與刺突蛋白結(jié)合并抑制其功能的新型蛋白分子或抗體；第二，設(shè)計(jì)出這種刺突蛋白的變體，例如使其擁有更高表達(dá)水平或熱穩(wěn)定性，從而誘發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)，以加快疫苗開發(fā)；第三，展開潛在藥物篩查，發(fā)現(xiàn)可與這種刺突蛋白結(jié)合并破壞其功能的小分子。

我國目前已有幾家公司獲批新冠病毒免疫學(xué)檢測試劑，可為新冠肺炎疑似患者提供快速檢測手段。其中有利用膠體金技術(shù)的抗體快速檢測試劑，也有蛋白酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒。

Molecular Devices的客戶——北京義翹神州科技有限公司，已自主開發(fā)成功新冠病毒 S 蛋白和 N 蛋白酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒，并將與合作伙伴開展臨床驗(yàn)證工作，迅速開發(fā)出免疫學(xué)抗原快速檢測試劑，用于臨床樣本的病毒抗原檢測，解決抗體試劑窗口期漏檢問題，獲批后有望廣泛應(yīng)用于基層人群高通量篩查。微孔板讀板機(jī)可以用來快速、高通量、自動化進(jìn)行酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)（ELISA）。

圖 3. SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī)：一體式觸屏、網(wǎng)端微孔板系統(tǒng)、操作簡便、數(shù)據(jù)自動分析、數(shù)據(jù)遠(yuǎn)程自動上傳

2.3 輔助檢測（臨床 CT 影像）

由于網(wǎng)絡(luò)上出現(xiàn)了多起新冠肺炎病毒疑似患者已表現(xiàn)出呼吸困難，CT 提示雙肺感染，但核酸檢測仍為陰性故而無法確診得到治療的情況。2 月 3 日，武漢大學(xué)中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科副主任張笑春教授在微信朋友圈發(fā)文建議：“強(qiáng)烈推薦 CT 影像作為目前新冠肺炎首選診斷方法”，隨著網(wǎng)絡(luò)發(fā)酵，引起社會廣泛關(guān)注。2 月 4 日，國家衛(wèi)健委辦公廳和國家中醫(yī)藥管理局聯(lián)合印發(fā)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第五版）》，將“疑似病例具有肺炎影像學(xué)特征者”作為湖北省臨床診斷病例標(biāo)準(zhǔn)。大量以前由于核酸檢測陰性無法確診的患者被收治，同時(shí)也阻斷了他們作為感染源感染其他人的可能。

以上介紹的是新冠肺炎病毒的檢測方式，現(xiàn)在我國新冠肺炎的傳播得到了有效控制，但韓國和意大利新增確診病例成上升趨勢，也有人預(yù)測新冠肺炎病毒可能轉(zhuǎn)成慢性疾病，像流感一樣與人類共存。無論后面疫情走勢如何，終極方案都是疫苗防治和藥物治療。

3.疫苗和新藥開發(fā)

3.1 疫苗開發(fā)

一般性流感疫苗大致分為以下幾類：全病毒滅活苗（Whole virus vaccines）、減毒活苗（Live attenuated influenza vaccine）、亞單位疫苗（Subunit vaccines）、裂解苗（Split-virus vaccines）、核酸疫苗（Nucleotide vaccine）和重組活載體疫苗（Virus-Vector-based vaccine）。

其中全病毒滅活苗和減毒活苗都是直接將具有感染性的完整的病原微生物進(jìn)行滅活或者減毒處理，保留其抗原性去除傳染性，可誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液或細(xì)胞等免疫應(yīng)答從而達(dá)到免疫的效果。而剩下的幾種疫苗研發(fā)方式則都設(shè)計(jì)到對病毒或者載體核酸序列進(jìn)行基因改造之后，導(dǎo)入新的載體細(xì)胞形成免疫蛋白或抗原，然后完成免疫應(yīng)答機(jī)制。

例如最近備受關(guān)注的天津大學(xué)新冠病毒疫苗的研發(fā)方法，就是其中的亞單位疫苗，他們以新冠病毒的 S 蛋白作為靶標(biāo)，通過融合表達(dá)質(zhì)粒，導(dǎo)入酵母菌中合成蛋白，以達(dá)到啟動免疫應(yīng)答的目的。在這個(gè)過程中，想要驗(yàn)證酵母菌是否合成目標(biāo)蛋白，除了進(jìn)行基因測序、蛋白免疫共沉淀法來驗(yàn)證外，也能通過高內(nèi)涵設(shè)備進(jìn)行大量細(xì)胞的免疫熒光篩選方式進(jìn)行驗(yàn)證。如下圖中所展示的天津大學(xué)新冠病毒疫苗的研發(fā)流程中，在疫苗菌株篩選及酵母疫苗株篩選的過程中，均用到了免疫熒光成像法來進(jìn)行，而這一步在高內(nèi)涵設(shè)備上，可以實(shí)現(xiàn)快速的全自動高通量篩選。

除此之外，剩下的裂解苗、核酸疫苗及重組活載體疫苗過程中，均需要通過基因改造的方式進(jìn)行生成具有效應(yīng)的免疫載體或免疫蛋白，在構(gòu)建過程以及最后的驗(yàn)證過程中，也同樣可以通過高內(nèi)涵設(shè)備來完成快速、大量的樣本篩選工作，提高疫苗研發(fā)的效率。

圖 4. 疫苗菌株構(gòu)建及篩選方案

圖 5. COVID-19 病毒 RBD-FP 域酵母疫苗菌株篩選及其口服制劑

圖 6. 共聚焦型高內(nèi)涵成像設(shè)備

合成目標(biāo)蛋白后可以用微孔板讀板機(jī)對其進(jìn)行定性、定量及純度檢測。獲得疫苗原液后，也需要用微孔板讀板機(jī)檢測前期疫苗培養(yǎng)、超濾、濃縮、層析等步驟中是否出現(xiàn)問題。

疫苗是否能產(chǎn)生抗體，產(chǎn)生的抗體是否具有免疫保護(hù)作用，需要用中和反應(yīng)來檢測。該方法是病毒性疾病中，不可取代的抗體檢測方法。中和反應(yīng)的基本方法是，將待檢物質(zhì)與活的病毒混合，感染細(xì)胞后，檢測細(xì)胞是否發(fā)生病變，從而反應(yīng)抗體阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的能力。微孔板讀板機(jī)可以檢測細(xì)胞活力、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡情況。

在疫苗生產(chǎn)階段為了確保疫苗有效性和批次間穩(wěn)定性，需要對特異性抗體進(jìn)行滴度檢測，衡量抗體識別抗原決定部位所需要的最低濃度（也即最大稀釋度)，也就是仍能產(chǎn)生陽性結(jié)果的最大稀釋度。通常通過 ELISA 方法來檢測抗體滴度，微孔板讀板機(jī)可以利用 96/384 孔板高通量完成抗體滴度檢測。

圖 7. SpectraMax Paradigm 多功能上轉(zhuǎn)發(fā)光微孔板讀板機(jī)

3.2 藥物開發(fā)

眾所周知，在大多數(shù)的藥物開發(fā)過程的前期工作中，如果能進(jìn)行大量體外細(xì)胞的毒理、藥理學(xué)驗(yàn)證，那么將在研發(fā)的早期就能篩選掉大量不符合條件的候選化合物，從而能夠?yàn)楹笃谂R床實(shí)驗(yàn)節(jié)省大量的研發(fā)成本。

微孔板讀板機(jī)和高內(nèi)涵成像設(shè)備正是在藥物開發(fā)的早期實(shí)驗(yàn)中，發(fā)揮它巨大優(yōu)勢的，通過海量樣本的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，如藥物的 EC50，IC50 驗(yàn)證等，除了可以通過微孔板讀板機(jī)進(jìn)行大量檢測外，通過高內(nèi)涵熒光成像的方式也可同步驗(yàn)證，還能在活細(xì)胞模組條件下，進(jìn)行長時(shí)間藥物反應(yīng)和細(xì)胞生長的檢測，獲得更加動態(tài)的有效數(shù)據(jù)。

圖 8. 通過長時(shí)間成像評估藥物對細(xì)胞的影響

圖 9. 用四參數(shù)曲線擬合繪制濃度相關(guān)響應(yīng)曲線，得到相應(yīng)藥物的 EC50 值

同時(shí)，在本次新型冠狀病毒的應(yīng)對過程中，除了需要研制針對病毒的治療手段，對肺部炎癥的治療也不可或缺。在研究抗炎藥物的過程中，采用多參數(shù)細(xì)胞分析的結(jié)果，使用表型成像考察巨噬細(xì)胞形成和低體積 ELISA 分析細(xì)胞因子的分泌，能夠更加全面的評估藥理學(xué)化合物對炎癥反應(yīng)的影響。

例如，在評估抗炎化合物時(shí)，分化的人單核細(xì)胞系 THP-1 細(xì)胞被廣泛用于體外巨噬細(xì)胞模型研究巨噬細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)。THP-1 細(xì)胞分化成巨噬細(xì)胞被量化測量的貼壁細(xì)胞數(shù)量使用 ImageXpress Pico 個(gè)人型高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)。采用基于低體積微流控技術(shù)的 PuMA 系統(tǒng) ELISA 定量測定細(xì)胞上清液中 IL-8、IL-1b 和 TNF-a 的含量。接著使用SpectraMax iD5 多功能微孔板讀板機(jī)測量吸光度，計(jì)算濃度和 EC50 值。PuMA 系統(tǒng)運(yùn)行 ELISA 小樣本量( 10-20 μl，現(xiàn)有抗體對 )。這增強(qiáng)了測量上清體積有限的多個(gè)細(xì)胞因子的能力。結(jié)合成像和低體積 ELISA 提供了一個(gè)有效的多參數(shù)分析系統(tǒng)，可以用來測試抗炎化合物的有效性，并提供對作用機(jī)制的深入了解。

圖 10. 多參數(shù)炎癥分析工作流程示意圖

當(dāng)篩選獲得備選藥物后，還需對抗病毒藥物進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證藥物對人體是否有害，抗病毒藥物一方面需要能夠遏制病毒侵害人體，另一方面藥物安全性評價(jià)也是至關(guān)重要的。微孔板讀板機(jī)同樣可以在藥物安全性評價(jià)中發(fā)揮作用，并提供了 96、384 ，甚至 1536 孔板的高通量細(xì)胞活力檢測方法，靈敏度上能和經(jīng)典的[3H]胸腺嘧啶摻入法（Thymidine Incorporation Assay）相媲美。

圖 11. EarlyTox Live/Dead試劑盒的檢測過程

無論是疫苗研發(fā)，還是新藥篩選，科研人員除了需要穩(wěn)定、快速、高通量的儀器，還需要操作簡單方便、能自動計(jì)算出結(jié)果，且符合GMP/GLP 要求的軟件合規(guī)環(huán)境。SoftMax Pro GxP 軟件，符合美國 FDA 最新的 2016 年 4 月數(shù)據(jù)完整可靠性指南分析中關(guān)于數(shù)據(jù)完整、安全、真實(shí)、有效和可追溯的要求；符合 CFDA 發(fā)布的 2018 版《藥品數(shù)據(jù)管理規(guī)范》；以及歐盟制定的被稱之為“史上最嚴(yán)的隱私條例”，于 2018 年 5 月 25 日正式生效的《通用數(shù)據(jù)保護(hù)條例》（General Data Protection Regulation）。所有用戶從登陸軟件開始，系統(tǒng)審計(jì)追蹤就以飛行記錄的方式，永久的、不可更改的記錄所有操作流程，確保最終檢測和分析結(jié)果的可靠性和真實(shí)性。當(dāng)然，我們也提供各種硬件驗(yàn)證服務(wù)，為科研設(shè)備的正常運(yùn)轉(zhuǎn)保駕護(hù)航。

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